Tp phosphatase alcaline
A+
l. Introduction Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme afin d’étudier [‘influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur sur la vitesse de réaction. Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de Snipe to nextÇEge phosphatase alcaline de veau. Il s’agit d’une e d’hydrolyser les mon s er or7 phosphoriques selon ré R-O-P03 2- + H20 R-OH + HP04 2- Il.
Principe rats, capable Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotométrique es produits apparus dans le milieu, lorsque l’enzyme est en présence de son substrat. Pour faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P- nitrophénolphosphate (PNPP) (. DO/min). De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gamme étalon de tubes contenant différente concentration (connues) de produit. On trace la droite 2Figpart2 DO f ([PNP]). En reportant l’absorbance d’une solution de concentration inconnue, on peut en déduire sa concentration. Manipulations préliminaires Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d’incubation, nous evons préalablement préparer les solutions de substrats de concentrations différentes. PAG » rif 7 glycérophosphate : Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphate ? 2,5mM et 1 rnM, à partir d’une solution mère à 5mM. 7mL 4mL 5mM 1rnM [GRO-P] 5mM 2,5mM Solution mère (mC) 10 PAGF3C,F7 effectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 mL dans 3,5 mL de milieu réactionnel, puis on prélève 1,75 mC de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL d’enzyme.
Première dilution (milieu A) : [pNpp] = (C pNpp. vpNpp) / v total PNPP] = / – 17,85 PM Deuxième dilution (cuve A): . [PNPPIB 20,90 PM . [PNPP]D 62,5 [PNPP] (C PNPP. VPNPP) / Vtotal (17,85. 10-3. 15,6 PM On procède de la même manière pour les autres milieux et on obtient: . [PNPP]C . [pNpp]E . [PNpp]F . [pNpp]G = 31,25 = 12495 NM 324,71 PM = 625,0 PM Calcul de la concentration de Pen me dans les milieux réactionnels: http://upload. wikimedia. org/wikipedia/commons/8/87/Michaelis -Menten. ng De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A à G), plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est mportante. Ainsi, la vitesse d’apparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat. Ensuite, pour un temps > 1 minute, II n’y a plus de relation linéaire (pour les milieux A, B, C, D, E). En effet, la quantité de substrat dans le milieu, diminue au fur et à mesure de la réaction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit formé donc l’absorbance n’augmente plus de façon linéaire. Pour et G, on remarque que pour un temps > Imin, la courbe reste linéaire.
Effectivement, la quantité de substrat est encore suffisante pour que la réaction ‘effectue à une vltesse initiale, maximale. Nous voulons déterminer [PNP]/min, c’est-à-dire la vitesse d’apparition du produit à partir de la pente . DO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur la gamme étalon na 1, et on regarde à quelle quantité de produit cela correspond. On obtient : . D0/rnin 0,0126 de la vitesse de réaction en fonction de [PNPP] : Grâce aux vitesses initiales déterminées précédemment, on trace la courbe de Mickaelis- Menten : Vi = Représentation graphique : http://vMw. hemistrydaily. com/chemistry/upload/O/06 Lineweaver-Burke_plot. PNG On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km • . Vmax 0,411 . DO/min Si on reporte cette valeur sur la gamme étalon no 1, on trouve Vmax = 24,9 pmole/min . Km = 23,4 pmole/L Ces valeurs ne sont que des estimations, la représentation de Mickaelis-Menten étant une courbe, il y a une importante mar e d’erreur lors de la détermination de Vmax. http://perso. univ-rennesl. fr/marie-andree. esnault/images/hanes A partir de la représentation de Lineweaver-Burke, on peut en déduire celle de Hanes- Woolf : Représentation eraphique