TP BIODIV

Approche pratique de la microbiologie des Eucaryotes : Introduction Les micro-organismes ont été les premières formes de vie à se développer sur Terre. Ils se répartissent en plusieurs groupes comme les Fungi, les Algues, les Protistes et les myxomycètes. Les eucaryotes pluricellulaires ne représentent qu’une petite fraction de la diversité totale. Ils se caractérisent notamment par la présence d’un noyau, de mitochondries ainsi qu’une multitude d’organite dans leur cellule.

Au cours de ce TP, n organismes eucaryot -Dicty dit amibe socia défavorables de son mibe en corps fructi de celle-ci. cn or 8 to nextggge -versité de ces micro- ‘entre eux : onditions me végétative ui assurent la survie -Deux apicomplexes Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum par la mise en évidence de quelques caractéristiques de leur vie intra-cellulaire. – ‘analyse par planche de microscopie électronique de différents groupes de protistes. Matériel et méthodes Dictyostelium discoideum Nous avons travaillé sur une amibe sociale : Dictyostelium disco ideum.

Lors de conditions nutritionnelles favorables, elle se multiplie ? l’état unicellulaire. Mais en conditions de carence nutritive, les (concentration cellulaire, quantité de nutriments disponibles, rôle de l’AMPC). Pour mettre en évidence la différenciation des cellules de spores et de tige nous disposons de 2 souches : ‘Dl 9’ et ‘EcmAO’ qui contiennent un plasmide contenant le gène lacZ respectivement sous contrôle d’un promoteur spécifique de spores ou de tige. développement de Dicty sur gélose phosphate Le but est de déterminer l’influence de la concentration cellulaire sur l’entrée du cycle de l’amibe. Pour cela, l’ensemencement de oites est réalisés selon les différentes concentrations cellulaires en tampon KK2. OBSERVATION EcmAO • 1 . IOA6 : présence de tout petits agrégats, la concentration est trop faible pour observer un cycle de développement. 1 . IOA7 : présence de corps fructifère avec des boules de spores très petites, les tiges ne sont pas larges.

La concentration en celllule est suffisante pour permettre un début de différenciation. 1 . IOA8 : présence de corps fructifères avec des boules de spores plus grande. C’est la concentration necessaire pour obtenir des orps fructifères entièrement différenciés. 5. 10A8 : présence de boule brunâtre correspondant aux boules de spores, on observe également des tiges et des pieds. Cette concentration permet la formation rapide et abondante de corps fructifères. D19: 1. 10A6 : idem 1 . 0A7 : quelques corps fructifères mais présence d’agrégat de cellules 1 : idem 5. 10A8 : idem difficulté à repérer les cha n ou les limaçon, ici soit il V -coloration et identification des cellules de spores et de tige dans les formes différenciées de Dicty A partir du développement de Dicty sur les géloses phosphates, ne coloratlon distincts des spores et tige est réalise avec le substrat X-Gal à partir des souches ‘Dl 9’ et ‘EcmAO’ comprenant chacune leur promoteur spécifique de spores ou de tige.

Pour la souche Dl 9, on observe une coloration au niveau des boules de spores. Pour la douche EcmAO, on obrserve une coloration au niveau des tiges. -influence des nutriments dans l’entrée en développement de Dicty Le but est d’observer le stade de développement de l’amibe par l’ensemencement de boite contenant des concentrations croissantes en nutriments (HL5). Cette amibe envoi des seudopodes pour se déplacer. Lors d’une carence alimentaire, les premières amibes émettent un signal et elles se déplacent toutes vers l’amibe qui a envoyé le premier signal.

Leur développement est Irréversible. 100% HL5 : on observe un forte multiplication de l’amibe au stade précédent le limaçon HL5 : présence d’agrégat et de quelques limaçons dû au développement des cellules dans le milieu riche mais aucune structure montrant l’entrée d’un cycle de développement. Le milieu présente des conditions trop favorables pour le début d’un cycle de développement. HL5 : on observe des formes intermédiaire ainsi que des limaçons. 25% et HL5 : présence de pied, de tiges et des spores. l faut donc que l’amibe soit en absence de nutriment pour qu’elle commence le début de so eloppement. PAGF3CFB -rôle de l’AMPc et chimiotaxie de Dicty au cours du développement Il s’agit ici de mettre en évidence l’étape d’agrégation, c’est à dire le passage de la forme unicellulaire à multicellulaire. pour cela on utilise différentes concentrations d’AMPc qui agit comme un chimio-attractant sur les cellules. O AMPc : développement de l’amibe mais absence de migration ers le disque. 1 AMPc : très légère migration pour les amibes prochent du disque.

IO AMPc : on ne voit pas de migration, cela est dû au fait que les gouttes ont étés déposées trop loin du disque. 100 AMPc : on remarque la présence de migration vers le disque. Donc en l’absence d’un signal ou d’un signal trop faible les cellules ne réagissent pas. Pour des concentrations intermédiaires du faite que le signal deviennent plus diffus plus on s’ éloigne du filtre seul celles à proximité le détecte. Et pour les concentrations plus importantes le signal est apté par un plus grand nombre de cellule.

Au niveau du développement, l’AMPc n’a pas d’effet quelque soit la concentration. Parasites Apicomplexes Nous avons travailler sur 2 parasites responsables de maladies tel que la toxoplasmose pour Toxoplasma gondii et le paludisme par l’agent Plasmodium falciparum. Ces parasites alternent leur cycle entre un hôte définitif et des hôtes intermédiaires comme l’homme où le cycle de multlplication asexuée se met en place. Ces parasites sont intracellulaires et modifie donc leur cellule hôte pour assurer leur survie au sein de l’organisme.

Toxoplasma gondii PAGF évidence par des expériences d’immunofluorescences les différents compartiments cellulaires, les organelles classiques présents chez tous les eucaryotes mais aussi les organelles du complexe apical comme les rhoptries, les micronèmes et les granules denses impliqués dans le mécanisme d’invasion. Marquage d’immunofluorescence de T. gondii Pour mettre en évidence ces différents compartiments, on utilise des anticorps spécifiques dirigés contre les organelles d’intérêt. Des anticorps secondaires couplé à un fluorochrome sont tilisées pour visualiser nos marquages par microscopie.

Plusieurs anticorps primaires ont été utilisés pour effectuer les marquages • -anti-SAGI : protéine de la membrane plasmique -anti-RON2 : protéine du col des rhoptries -anti-ROP2: protéine du bulbe des rhoptries -anti-MlC3 et AMAI : protéine de micronème -anti-GRAI : protéine de granule dense Les anticorps secondaires sont alors utilisés, ce qui permettra d’observer la fluorescence à la plateforme de microscopie. Certaines lamelles ont été traités au Mitotracker pour marquer la itochondrie et nous avons utilisés une solution de Hoechst afin de marquer les noyaux toutes les lamelles.

Observation des lames d’immunofluorescence de T. gondil Les organites sont sécrétées au cours de l’invasion et les protéines se retrouvent dans la cellule hôte. Les micronèmes sont présent au niveau de l’invasion et se retrouvent à la surface du parasite et joue le rôle d’adhésine avec la cellule hôte ainsi que la mobilité grâce à l’actine. Cela active les rhoptries qui comportent 2 com artiments : le bulbe et le col. vau, la membrane Pour SAGI : on remarque