TP1 PAlk Homogene 1

ENZYMOLOGIE EN PHASE HOMOGENE: ETUDE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE Les phosphatases ou phosphomonoestérases sont des enzymes qui hydrolysent les monoesters phosphoriques avec formation de phosphate mlnéral et d’un alcool ou d’un phénol, selon la réaction: R-O-P032- HP042- R-OH + METHODOLOGIE La manipulation per facteurs sur la réacti enzymatique. Lienzy partiellement purifiée de or 12 to View de plusieurs ration commerciale phosphatase intestinale de veau, la réaction sera suivie en dosant les produits apparus dans le milieu lorsque l’enzyme est mise en présence du substrat.

Pour des raisons de commodité, ce ernier est le para-nitrophényl phosphate (pNPP), composé incolore qui libère par hydrolyse en milieu alcalin du p-nitrophénolate (pNP) jaune et dosable directement par spectrophotométrie à 41 Onm. pNPP incolore pNP jaune (dosable à max= 410nm) pNPP permet d’éliminer le recours ? une réaction auxiliaire pour doser les produits formés, ce qui serait le cas si on voulait suivre par exemple la libération de phosphate minéral dans le milieu.

MATERIEL ET PRODUITS Matériel Bain thermostaté à 37ac Chronomètre – Spectrophotomètre à 41 0 nm Agitateur Vortex pour tubes à essai – 40 tubes à essai 1 portoir de 24 tubes – 1 portoir de 12tubes 1/11 Produits – Na2HP04 0,5M – Tampon Tris-HCl 0,1 M pH 8,3 -p-nitrophényl phosphate (pNPP) hydraté à 6 H20 5mM. Faire une solution à 185 mg/ 1 OOmL à consen. ‘er au froid et de préférence au congélateur, ce produit subit une hydrolyse spontanée et la solution présente une coloration jaune par libération de pnitrophénolate (pNP). -nitrophénol (pNP) 0,5 mM (7mg/1 OOmL) – zn C12 0,6TlM (82 mg/L) – a-glycérophosphate 5 mM (1 ,53mg/mL) – solution d’enryme: phosphatase de mucus intestinal de veau. Selon les lots, l’activité specifique varie de 0,5 à 2,5 U/mg. Faire une solution aqueuse contenant environ 50 IJ/ 1 la concentration exacte de l’enzyme utilisée pour la manipulation sera précisée en cours de séance; cette solution peut être conservée plusieurs jours à 40C sans d’activité.

PAGF 19 les précautions habituelles en ce qui concerne les pipettages dans le cas de pipettages de solutions d’un même produit à différentes concentrations, réaliser ces pipettages dans l’ordre croissant des concentrations; ne pas oublier d’essuyer l’extérieur de la pipette avec un morceau de papier-filtre entre le prélèvement de la solution et son dépot dans un tube à essai. l’omission de cette précaution entraîne des erreurs expérimentales importantes et d’autant plus grandes que les volumes pipettés sont plus petits. Avant la séance de T. P. , il sera indispensable de relire très attentivement les chapitres de votre cours d’Enzymologie traitant des ordres de réaction, des propriétés cinétiques des enzymes non allostériques et des inhibiteurs des réactions enzymatiques. GAMME ETALON NO 1 Préparer 6 tubes: Tampon Tris-HCl 0,1 M pH 8,3: 0,75 ml. 2 4 19 qui sera joint au compte rendu, ces dilutions seront effectuées en cascade afin d’éviter le pipettage de faible volumes ui serait nuisible à la précision des résultats. réparer environ 10 ml_ de chaque dilution. 2) a- glycérophosphate: A partir de la solution à 5mM, préparer des solutions à 2,5 mM et 1 mM (10 ml_ par concentration). ETUDE CINETIQUE DE LA LIBERATION DES PRODUI S DE LA RÉACTION 1) Principe On confectionne une série de milieux d’incubation identiques dans lesquels la réaction est effectuée pendant des intervalles de temps connus. Par dosage du pNP libéré, on détermine de quelle manière la concentration ou la quantité des produits de la réaction evolue au cours du temps.

On peut en déduire certaines caractéristiques de la éaction: vitesse initale pour une concentration donnée du substrat, ordre de la réaction, constante de vitesse apparente. Par ailleurs, cette étude constitue une étape préalable avant d’aborder la détermination de paramètres cinétiques propres à lienryme pour un substrat donné: KM, Vmax, activité spécifique 2) Mode opératoire Manipulation préliminaire Dans un portoir de 12 tubes, préparer 7 tubes (A à G) contenant: 1,5 mL de tampon Trjs-HCI PH 8,3; ml de znC12 I mu d’eau distillée.

Incubation série A – Retirer le tube A du portoir, ajouter ml_ de pNPP 0,125 mM. Agiter au Vortex aisser préincuber dans un bain marie à 37 oc pendant 5 minutes. Préparer un prélèvemen olution enzymatique. PAGFd0F19 de spectrophotomètre au moins 5 minutes à 30C. – Ajouter 1,75 mL du milieu réactionnel A dans la cuve. – Placer la cuve dans le spectrophotomètre. _ Faire le zéro. – Commencer la réaction par ajout de 0,25 ml de ‘enzyme, mélanger rapidement à l’aide d’une baguette et enregistrer les variations de DO à 410 nm pendant 7 minutes.

Incubations série B à G – Les solutions de pNPP utilisées sont les suivantes: 0,167 mM 0,25 mM rnM 1 2,5 5 rnM – Effectuer le démarrage de la réaction dans les tubes B à G xactement comme pour la série A mais enregistrer les variations de DO seulement pendant 3 minutes. Mesures – Mesurer d’après la pente de la partie linéaire de chaque courbe la valeur de ADO/ min (tableau 2). – Lire les D. O. des tubes de la gamme étalon Nb 1 et les porter dans le tableau 1. Compléter ce tableau en indiquant les quantités de pNP présentes dans chacun des tubes de la gamme.

Tracer la courbe étalon (Fig. 1 a). Calculs et interprétation – Représenter les courbes obtenues pour chacune des concentrations de substrat utilisées, sous la forme d’un faisseau de courbes (Fig. 2). – Commenter les courbes. Pendant combien de temps la réaction suit-elle une marche linéaire? – Déduire d’après la eamm uantités de pNP/ min PAGF 12 pNPP + H20 pNP + Pi. Si elle pouvait être réduite à une seule étape élémentaire irréversible, la vitesse de réaction serait dans le cas général de la forme v = k [pNPP] [H20] d’ordre global 2.

En solution aqueuse, on peut considérer que [H20] = 55,5 M = Cte et l’ordre global se réduit alors à 1. Par ailleurs, ce raisonnement simplifié ne prend pas en compte l’existence de plusieurs étapes élémentaires mettant en jeu l’enzyme, ce qui fait que la vitesse de la réaction era une fonction plus complexe de la concentration du substrat, avec un ordre de réaction variable selon les conditions expérimentales: concentration du substrat, durée de la réaction et ne s’exprimant pas en règle générale par un nombre entier.

En toute rigueur, la phosphatase alcaline est une enzyme à deux substrats, ici le pNPP et l’eau, cependant l’eau est en très large excès et la vitesse de réaction ne dépendra expérimentalement que de la concentration du pNPP. La cinétique observée obéit à l’équatlon de Henri-Michaelis et Menten: la vitesse initiale obtenue pour une oncentration donnée de PNPP est de la forme v = vrnax / (KM +[FDNPP]) (1) dans laquelle Vmax et KM sont des constances caractéristiques du couple enzyme-substrat dans des conditions expérimentales définies.

Etude graphique de la vitesse de la réaction en fonction de [pNPP] – Représenter graphiquement la vitesse initiale de la réaction en fonction de [pNPP] (Fig. 3) – En déduire une estimation des valeurs de Vmax et KM. Cette détermination est-elle être récise? Pourquoi? N. B. : Ces deux derniers p être en partie étudié détermination est-elle être précise? Pourquoi? N. B.

Ces deux derniers points pourront être en partie étudiés sur des bases théoriques avant la Détermination de la vitesse maximale et de la constante de Michaelis La relation v = f (S) (1) peut être avantageusement remplacée par une transformée 4/11 linéaire parmi lesquelles la plus couramment utilisée est la représentation de Lineweaver et Burk – Déduire de (1) l’expression théorique de l/v = f (1/ [pNPPl) et ? partir de cette dernière l’expression théorique de [pNPP]/v -f [pNPP]. Quelle est la représentation graphique de ces relations?

Pourquoi est-elle préférable à (1 ) pour le calcul de Vmax et KM? Calculer 1/[pNPP], l/v et [pNPP]/v et compléter le tableau 2. – Représenter graphiquement 1 ‘v en fonction de 1/[pNPP] (Fig. 4a)et en fonction de [pNPPl (Fig. 45). Commenter les courbes obtenues. Déterminer les valeurs de Vmax et KM. Ordre de la réaction D’après la courbe de la Fig. 3, quel est l’ordre approximatif de la réaction pour de faibles concentrations de ce substrat? Commenter brièvement vos conclusions en relation avec le mécanisme de la réaction.

Détermination de l’activité spécifique de l’enzyme dans les conditions expérimentales utilisées A partir de la valeur de Vmax obtenue, exprimer l’activité pécifique de l’enzyme en 7 2 présence de Zn2+, donner une estimation de l’activité spécifique de l’enzyme en présence de Mg2+. La valeur de cette dernière activité mesurée par le fabriquant pourra vous être communiquer à titre de comparalson. INHIBITION DE L’ACTIVITE PHOSPHATASE ALCALINE Les inhibiteurs des phosphatases alcalines peuvent être classés en plusieurs catégories.

On distingue ainsi (a) les inhibiteurs complexants qui enlèvent ? l’enzyme les ions bivalents nécessaires à son fonctionnement: c’est le cas pour l’EDTA, le a, a’-dipyridyle, la O-phénantroline et, dans une moindre mesure certains minoacides ou amines, le KCN, etc (b) des analogues inactifs des ions activateurs: Cu++, ge++; (c) des analogues structuraux des substrats représentés par certains anions: phosphate, arseniate, pyrophosphate, borate, carbonate, par les polyphosphates organiques; et (d) par de nombreux alcools, par le lévamisole…

Les effets de ces inhibiteurs sont souvent irréguliers et ils ne donnent que rarement lieu à des cinétiques bien définies, leur action varie considérablement selon l’enzyme utilisée (espèce et organe d’origine, degré de purification) et selon les conditions expérimentales: le évamisole se comporte ainsi comme un inhibiteur puissant ou comme un composé inactif selon l’enzyme étudiée; des traces d’agents complexants exercent paradoxalement un effet activateur sur les préparations impures en les débarrassant d’ions inhibiteurs tels que Cu++; le phosphate et les alcools c s cinétiques en principe 12 cinétiques en principe compétitives mais sont simultanément des produits de la réaction, ce qui peut compliquer l’interprétation des résultats.

GAMME ETALON NO 2 6 Tampon Tris-HCl M pH 8,3: 1,5mL doit être effectuée impérativement par deux opérateurs: 1 er opérateur: démarrage de la réaction Ajouter de minute en minute 0,5 mC de la solution enzymatique préincubée à chacun des tubes A 1 à C7, agiter immédiatement le tube au Vortex et le remettre au bain-marie (déclencher le chronomètre et intervenir au temps 1, 2, 3, 4, 5, 6, et 7 min pour les tubes Al, A2, AB, A7). 2ème opérateur: arrêt de la réaction 6/11 – Arrêter la réaction par addition de 1 rnL de Na2HP04 M, en respectant la durée d’incubation (x) qui devrait être la même pour chaque tube, et agiter immédiatement le tube au Vortex.

On interviendra donc de minute en minute aux temps x, x+l, x+2, x+3, etx+7 pour les tubes A 1, A2, AB, et A7. Il sera utile de préparer un tableau des opérations à effectuer pour éviter tout risque de confuslon au moment de l’expérience. -Ajouter 1 ml_ de Na2HP04 M puis ml_ de solution enzymatique à chacun des tubes de la série D. Mesure -Lire les DO des tubes Al à D7 à 410 nm. Faire le zéro optique sur l’eau distillée. Porter les DO lues et corrigées dans le tableau en précisant les calculs effectués. -Lire les DO des tubes de la gamme étalon et les porter dans le tableau 4. Tracer la courbe étalon (Fig. 1 b). 3) Calculs et interprétation – Déterminer les quantité tions de pNP libérées