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TSB 303 – Méthodes analytiques en biologie Partie du Pr. Brian Talbot (60 points) 1. Lisez le texte suivant et répondez aux questions. (suggestion: Lisez les questions avant de lire le texte) Nous avons dosé des anticorps bovines anti-Staphylococcus aureus par I’ELISA suivante : Le bactérie a été déposé dans les puits d’une plaque de microtitration en PVC (300 pl/pults dune solution de Ing/ml de bactérie purifié, dans 0,1 M NaHC03 pH 9. 0) et incubé 3 heures à 200C. La plaque a été ensuite saturée avec 100 Oltpuits de à 40C pour la nuit.

La solution de lavage (P Les antisérums bovin Swape nextp g ns PBS et incubée ?e 5 fois avec la en-20). éposés dans les puits (200 al d’une dilution 1 : 3000 dans l’eau distillée) en duplicata et incubés 2 heures à 40C. On à vidé la plaque et ensuit on a ajouté 200 Dl d’un anticorps commercial chevre anti-bovin lg- peroxydase. L’incubation de 30 minutes à 40C a été suivie d’une autre série de 5 lavages. La réaction colorimétrie a été obtenue grâce à la solution chromogène (0,015 mg de TMB, ml de peroxyde 30%, dans 30 ml de PBS) dont on a ajouté 200 Dl à tous les puits.

La densité optique de chaque puits était lue après 15 minutes à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Les microplaques ont 96 puits de volume 0,3 ml chacune. Nous avons util Sv. ‘ipe to utilisé : 78 puits pour les inconnus 6 puits pour les témoins positifs (anti-S. a. connu) 6 puits pour les témoins négatifs (pas d’anti-S. a) 6 puits pour les blancs sans antigène a) L’ELISA n’a pas bien fonctionné. Une activité faible de peroxydase a été trouvée dans tous les puits incluant les blancs. Identifiez des erreurs dans le protocole et expliquez brièvement comment les corriger.

Réponse • 1. Faire un lavage après l’incubation suivant l’ajout de bactérie 2. Erreur majeure : Seulement 100 microlitres de la solution de aturation (blocage). Le sérum de souris agit comme solution de blocage. (On a besoin d’au moins 300 microlitres (ou seulement 100 microlitres de bactérie pour la première étape). 3. Je préfère les triplicata des antisérums à tester. 4 Les antisérums à tester sont à diluer en PBS, pas dans l’eau. 5. La température est trop basse pour l’incubation des inconnues. Incubez 2 heures à 200C ou à 370C 6.

Commenter sur la dilution de l’anticorps anti-lg bovin- peroxydase 5. La température est trop basse pour l’incubation avec ac- peroxydase. Incubez à 200C ou 370C . 7. Avant de lire la D. O. , on arrête la réaction avec de l’acide. ) Estimez le volume approximatif de PBS requis pour l’expérience : réponse : 500 ml. 2 OF s Naci – – 58,4) Ajustez le pH avec 3M NaOH (disponible dans le laboratoire) R. J’espère que vous êtes capables de faire ces calculs d) L’expérience a pris combien de temps (heures)? Approximativement 24 heures. (le nuit a 16 heures) e) Écrivez votre protocole pour l’ ELISA 1.

Déposer 1 aoul de bactérie dans chaque puits (sauf pour 6 puits) à 3ng/ml dans M NaHC03 pH9,O. 2. Incuber 3 heures à 20 oc 3. Laver 3 fois avec tween. 20 4 Ajoutez 0,3 ml par puits de sérum de souris dilué 1:10 dans PBS (la solution « blocante ») . Incuber la nuit à 4 oc 6. Laver 3 fois comme #3 6. Déposer 200ul par puits, de chaque antisérum à tester, dilué 1 : 3000 en pas (triplicata pour chaque échantillon à tester) sauf pour les 12 puits de témoins positifs et négatifs et les 6 puits de témoins négatifs de l’antigène. . Choisir 6 échantillons (dilués), et mettre 200ul de ch. dans les 6 puits sans bactéries, ( les témoins négatifs pour l’antigène) 8. Ajouter 200 ul de 6 dilutions d’un sérum ayant une quantité connue de anti-S. aureus dans 6 puits (vos témoins positifs). 9 Ajouter 200ul de 6 dilutions d’un sérum sans l’anticorps contre S. aureus (les témoins négatifs). 8. Incuber 2 heures à 37 oc 9. Laver 5 fois comme #3 10. Ajouter 200 ul de la solution d’anti-lg bovine-enzyme (dilué selon les instructions du fournisseur) 11.

Incuber 30 minutes à 370C 12. laver 5 fois comme en 3 OF s comme en #3 13. Ajouter la solution chromogène (substrat) à 200 ul par puits. 14. Après 15 minutes, ajouter 50 ul de l’acid sulfurique IM , agiter doucement. 15. Lire le D. O. à 450 nm. 2) Distinguez entre : a) La partie Fab et la partie FC d’un anticorps. b) Un sérum et un antisérum c) un epitope et un antigéne voir ; http://anne. ecoster. free. fr/immuno/dico/dicoimmu. htm 3) Expliquez les principes et les objectifs de l »immunoprecipitation . Utilisez un schéma si nécessaire.

Je préfère un schéma mais : R. L’immunoprécipitation (IP) est une technique qui permet d’aller chercher par la liaison Ac-Ag une protéine ou un peptide en particulier à travers un mélange complexe de protéines. Canticorps sert en fait ici, d’outil de purification de la protéine d’intérêt : l’antigène. La « précipitation » du complexe Ac-Ag se fait à l’aide de billes de sépharose recouvertes de protéines ou anticorps qui ont une rande affinité pour les Immunoglobulines (lg) et permettent donc d’immobiliser les Ac aux billes.

Dans un mélange de protéines, tel un lysat cellulaire, seules les protéines antigéniques lieront spécifiquement les Ac fixés aux billes. Le complexe Ac- Ag est ensuite retiré du mélange de protéines, car les billes sont facilement séparées d’une solution par centrifugation. L’antigène est séparé des billes ar changement de pH ou changement de force ioniq ectrophorèse sur gel de 4 OF S ou par félectrophorèse sur gel de polyacrylamide SOS. 6. Vous avez trouvé des bouteilles qui portent des étiquettes uivantes :  » lapin anti-IgG4- urease » o d) « antisérum de souris anti- sérum de cheval’ Expliquez ces étiquettes. si possible) R. C : l’antisérum d’un lapin qui contient des anticorps contre lgG4. Ces anticorps sont attachés à l’enzyme uréase. (On ne connaît pas l’origine de l’IgG 4). D : L’antisérum d’un souris qui a été injecté avec le sérum de cheval. 7. Vous avez besoin de 320 ml de la solution suivante pour votre ELISA 0,02M Tris-HCL O. 03mM EDTA 0,012 mM mercaptoéthanol MgC12 (v/v) Tween (pH final de 7. 8) Expliquer comment préparer la solution en employant les solutions mères suivantes IM Tris S OF s