Compte rendue- analyse d’activité subcellulaire
A+
Toujours à partir de la solution mère de BSA 1 mg/mL, des dilutions contenant 10, 15, 20, 25gg de BAS ont été réalisées de la même manière pour obtenir un volume final de 2mL. 2- Réalisation des milieux réactionnels pour déterminer les valeurs d’absorbances de la lactate déshydrogénase, des milieux réactionnels ont été préparés. Pour cela, 400pL de tampon 0,1 M pH 7,4 ont été ajoutés à 5pl_ de Pyruvate 100mM, 20gL de Triton 100X 10%, 10pL de roténone lmg/mL 20pL de NADH 10mM et une quantité suffisante d’H20 pour un volume final de 1 mC.
Pour déterminer les valeurs d’absorbances de la glucose-6- hosphatase, des milieux réactionnels ont été préparés de 2 valeurs d’absorbances de la glucose-6-phosphatase, des milieux réactionnels ont été préparés de la façon suivante 50pl_ de Tampon acétate IM pH6,25 ont été ajoutés à 50pL de Gucose-6-phosphate o,2M pH8,2, de friton X100 10%, de fraction ainsi qu’une quantité suffisante d’H20 pour un volume final avec le TCA de IM Dans 6 des tubes (5 fractions et un contrôle), 500pL de TCA ont été ajoutés directement dans les milieux réactionnels. Dans 5 autres tubes préparés de la façon précédente, 500pL de
TCA à a été ajoutés après incubation de 10 mn à 37 oc. Tous les tubes ont ensuite été centrifugés 1 min à 10 000g. 3- Réalisation des dosages Pour déterminer Factivité de la lactate déshydrogénase, un dosage de NADH oxydé a été réalisé à partir des tubes préparés précédemment. La réaction a été démarrée par l’ajout de fraction puis l’absorbance a été mesuré toutes les 10 secondes pendant 1 minute. Pour déterminer l’activité du glucose-6-phosphatase, un dosage en Pi selon Ames a été réalisé à partir de la gamme étalon et les tubes préparés précédemment.
Le dosage a été effectué en de série contenant respectivement 250pL des 1 1 tubes de milieu complété avec 250pL d’eau pure et 500gL des 11 tubes de milieu. Dans les deux séries de milieu ainsi que dans la gamme étalon ont été ajouté 2,5mL de réactif de Ames ( Molybdate d’ammonium, A 3 dans la gamme étalon ont été ajouté 2,5mL de réactif de Ames ( Molybdate d’ammonium, Acide ascorbique, SDS) puis ont été Incubés pendant 1h à température ambiante puis mesurés 820nm. our doser les protéines selon BRADFORD, chaque fraction a été diluée d’un facteur 20 dans de l’eau distillée. Trois séries ont été réalisées à partir des fractions diluées contenant respectivement 5pL, IONI- et 15pL de fractions diluées et un volume suffisant de réactif de BRADFORD a été ajouté pour obtenir une solution de volume final 2mL. ‘absorbance des tubes a été lue à 595nm. 4- Réaction oxymétrique Pour mesurer Pactivité de la cytochrome oxydase, l’oxygène consommé a été mesuré dans un oxydomètre.
Dans la cellule ont été ajoutés 600pL de tampon phosphate 50XlM PH7,2 EDTAINIM, d’ascorbateo,l M, 30WL de cytochrome C 2mM, 10pL TMPD 50mM ainsi qu’un volume d’eau uffisant pour obtenir un volume final de lmL La mesure a été commencée à partir de l’ajout de 50pL de fraction dilué 0,1 fois. Résultats et interpretatlons.