Chromato Liquide 2007

r Jean-Louis CUQ CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE Professeur Jean-Louis CUQ page 1 r Jean-Louis CUQ – LA CHROMATOGRAP TABLE DES MATIERES l. HISTORIQUE or 128 Sni* to View Il. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE 4 Ill. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES 1. Selon la nature des phases 2. Selon la nature des phénomènes mis en jeu 3. Selon la technique mise en jeu IV. THÉORIE DE BASE – GRANDEURS FONDAMENTALES Coefficient de distribution 1 .

Grandeurs de rétention Ill – Phases greffées polaires 3. Adsorbants de type IV – Phases greffées apolaires a) mécanisme de rétention ) influence de la phase mobile – élution en mode isocratique – élution en mode gradient c) augmentation de k’ (fixation covalente, appariement d’ions) 2. La chromatographie de partage 1) Phases stationnaires 2) Phase mobile 3.

La chromatographie d’échange d’ions 1) Principaux types de groupements fonctionnels 2) Principaux types de matrice 3) Influence du pH de la phase mobile 4) Influence du type et de la concentration en contre ion 5) Effet de la température et de solvants organiques 6) Analyse avec suppresseur de phase 4. La chromatographie d’exclusion 5. La chromatographie chirale 6. La chromatographie d’affinité VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE Dispositifs dobtention de gradients 2. es pompes . Les injecteurs 4. colonne Les particules support de phase stationnaire 6. La nature des phases stationnaires 7. Les connexions . Les détecteurs VIII. QUANTIFICATION 1. Mesure de l’aire par triangulation ou au moyen d’intégrateurs 2. Mesure des coefficients de réponse 3. Influence des conditions opératoires sur l’analyse quantitative 28 31 très ancienne. Ainsi on trouve la première référence d’un processus chromatographique dans l’Ancien Testament qui fait ention de propriétés adsorptives de certaine variété de bois pour adoucir de l’eau amère.

Ce sont les tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (chromatographie d’adsorption) Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l’eau de mer. Les phénomènes mis en jeu relèvent ici de Péchange d’ions. Au XVIème siècle, le strasbourgeois BRUNSWIC purifiait de l’éthanol en faisant passer la vapeur ? travers une éponge impregnée d’huile d’olive et réallsait une expérience de chromatographie gaz-liquide 00 ans avant la « découverte » de cette technique.

Toutefois, ce n’est qu’au début du XXème siècle, plus précisément le 21 mars 1903, que naquit la chromatographie. Ce jour-là TSWETT, botaniste d’origine russe, présenta à Varsovie son premier article sur une nouvelle sorte de phénomène d’adsorption et son application à l’analyse biochimique. Il y décrivait la formation de zone colorées lors de l’élution par l’éther de pétrole de pigments végétaux dans une colonne remplie de carbonate de calcium.

L’origine du mot chromatographie vient peut-être de cette séparation de composés colorés puisque CHROMA (Kpwua) en grec, signifie couleur. Puis les travaux de TSWETT tombèrent dans l’oubli pendant une vingtaine d’années et il faudra attendre 1931 la publication de KUHN et LEDERER sur la séparation des isomères du carotène et de la xanthophylle pour assister au développement de la chromatographie en tant qu’out carotène et de la chromatographie en tant qu’outil analytique.

A partir de cette date, la chromatographie prit son véritable essor – 1 934, premier livre de ZECHMEISTER et CHOLNOKY, qui par son succès, contribua à vulgariser la chromatographie. – 1938, KUHN reçut le Prix Nobel. Livre La chromatographie en phase mince par IZMAILOV et SCHRAIBER Chromatographie d’échange d’ions sur zéolithes. 1941, La chromatographie de partage, MARTIN-SYNGE – 1944, La chromatographie sur papier, CONSDEN-GORDON, MARTIN – 1 948, prix Nobel à TISELIUS (premier détecteur optique par mesure du changement d’indice de réfraction, premier système de gradient d’élution) 1952, prix Nobel à MARTIN et SYNGE MOORE et STEIN Chromatographie d’échange ionique (Prix Nobel) – 1959, Chromatographie sur gel (PORATH, FLODIN) – 1 969, Avènement de la chromatographie liquide moderne HPLC, FPLC) page 4 Il s’agit de la réalisation d’un tri entre les différentes espèces moléculaires d’un mélange.

On va ainsi forcer toutes les molécules à effectuer un parcours commun parsemé d’obstacles : certaines espèces le franchiront aisement d’autres auront plus de difficultés. A l’arrivée, il y aura échelonnement. Pour entraîner les molécules il faut les véhiculer dans un fluide : la phase mobile qui peut êtr doit être fixe et produire des effets reproductibles : il constitue la phase stationnaire. Cette phase stationnaire, le plus souvent emprisonnée ans une colonne, peut être un solide ou un liquide immobilisé sur un solide.

La séparation idéale est schématisée sur la Figure 1. application développement réponse temps Figure 1. Séparation chromatographique idéale Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d’ordre thermodynamique: la rétention de l’échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement. Il est nécessaire qu’il y ait interaction entre l’analyte et la phase stationnaire. En pratique la séparation idéale n’est pas réalisable. Alnsl il se produit un élargissement des bandes en raison surtout es phénomènes de diffusion.

Les facteurs qui contrôlent la diffusion sont surtout de nature cinétique et peuvent être considérés indépendamment des facteurs thermodynamiques qu influencent la rétention (figure 2). Figure 2. Séparation chromato ra hi ue réelle (non idéale) chromatographie en phase gazeuse – la chromatographie en phase supercritique CPL CPG cps Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: – la chromatographie gaz / solide – la chromatographie gaz / liquide – la chromatographie liquide / solide – la chromatographie liquide / liquide CGS CGC ccs CLL

La chromatographie en phase supercritique est une chromatographie dans laquelle la phase mobile est un gaz comprimé (à sa température et à sa pression critique) ou une phase liquide / vapeur de même densité (au-delà de la température critique, le gaz ne peut être liquéfié quelle que soit sa pression). Avec cette phase mobile, le plus souvent l’anhydride carbonique, la durée de l’analyse est de 5 à 10 fois plus courte qu’avec les phases mobiles liquides.

De viscosité très faible, cette phase mobile permet un couplage facile avec des détecteurs comme le spectromètre de masse ou le étecteur par mesure de la diffusion de la lumière. 111. 2. Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules ? separer. On distingue ainsi: phénomènes étudiés correspondaient essentiellement à des interactions de type liaison hydrogène.

D’autres phases ont été utilisées depuis avec des mécanismes d’échange impliquant des liaisons Van der Waals, hydrogène et des interactions hydrophobes (cf chapitre VI). Il s’agit de chromatographie liquide-solide (CL S) 111. 2. 1. La chromatographie de partage La séparation est fondée sur les différences de solubilité des molécules à séparer entre phase mobile et phase stationnaire liquide (phase qui imprègne ou qui est greffée sur un solide). Il s’agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).

On multiplie ici les partages entre phases de la même façon que si lion disposait de plusieurs milliers d’ampoules à décanter contenant deux solvants non miscibles. 111. 2. 3. La chromatographie d’échange d’ions La phase stationnaire est un solide à la surface duquel se trouvent des groupements ionisés : échangeur ‘ions. un soluté ionisé de charge opposée se trouvera d’autant plus retenu que sa charge (opposée à celle page 6 de la phase stationnaire) sera plus forte.

C’est la loi de COULOMB qui régit ces échanges de forte énergie (40 à 80 kJ. mole-1) : 2 d encore qualifiée de chromatographie de perméation ou de filtration sur gel La phase stationnaire est un solide poreux dont la dimension des pores est voisine de celle des molécules ? séparer : celles qui sont trop volumineuses pour pénétrer dans les pores sont exclues de la phase stationnaire et sont éluées les premières.

Ici encore on peut parler indifféremment de CCS ou de CLL. 111. 2. 5. La chromatographie d’affinité Très utilisée par les biochimistes, elle consiste à fixer par exemple une enzyme sur la phase stationnaire de façon à complexer sélectivement les substrats correspondants (ou vice versa). Il s’agit là d’une associatlon entre une molécule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites stériquement définis et de capacité d’échange multiple.

Il s’agit souvent d’un système coopératif d’interactions différentes (ioniques, hydrophobe, Van der Waals, hydrogène), liaisons arfaitement positionnées dans l’espace. Il est bon de rappeler qu’il ne peut pas exister de phase stationnaire « inerte Quelle que soit sa structure elle sera toujou s capable de donner des interactions d’un type donné. Dans la mesure où le système requiert un niveau dinteraction le plus faible possible, c’est par les choix judicieux des phases mobiles et stationnaires qu’il sera possible d’y parvenir. 111. 2.

Classification selon la technique mise en jeu Selon la technologie mise en jeu on distingue: – la chromatographie sur colonne – la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou hromatographie sur couche mince). IV. THEORIE DE BASE – GRANDEURS (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche IV. THEORIE DE BASE – GRANDEURS FONDAMENTALES En chromatographie en phase liquide, les séparations sont basées sur la différence de distribution des espèces entre deux phases non miscibles l’une stationnaire (particules solides imprégnées ou non d’un liquide), l’autre mobile (liquide).

Pour un système chromatographique donné, le coefficient de distribution K (ou coefficient de partage) est défini par: Cs Cs : concentration du soluté dans la phase stationnaire Cm : concentration du soluté dans la phase mobile. page 7 Si les molécules d’un mélange ont des affinités différentes pour chacune des deux phases, il apparaît des différences entre deux vitesses de migration d’où possibilité de séparation.

La migration sera d’autant plus lente que ‘affinité de la molécule pour la phase stationnaire sera grande. Rappelons que la solubilité d’un analyte dans une phase mobile donnée passe d’abord par la possibilité d’établissement d’échanges (liaisons). Sans échange il n’y a pas de solubilité possible et deux phases apparaissent. Une bonne séparation en ie liquide implique : deux pics successifs dépend de la distance séparant les sommets et leur largeur. 3. que l’analyse soit aussi rapide que possible.

IV. I. GRANDEURS DE RETENTION Si la quantité injecté est petite on obtient pour chaque composé élué un pic symétrique et gaussien (figure 3). On définit ainsi les paramètres suivants : IV. 1. 1 . Le temps de rétention (tR) Cest le temps d’élution au maximum du pic mesuré à partir de l’injection. Un chromatogramme type est schématisé, avec les paramètres principaux d’évaluation, sur la figure 3. h volume mort 0,607 h 20 point mort injection 0,607 PAGF 98