BTS 2012 Rapport de stage

Remerciements Je tiens à remercier, e Pr. Ayikoe Guy Mensah-Nyagan, directeur de l’unité « Stéroïdes, Neuromodulateurs et Neuropathologies, EA-4438 qui m’a permis de réaliser mon stage. e Dr. Marie-Hélène-30utigue, responsable de l’unité 977 de l’INSERM pour m’avoir accueille au sein de son équipe, ainsi que pour le temps et la confiance qu’elle m’a attribuée, Le Dr.

Laurence Mey permis de rencontre les différents échant de toutes les explicat accordée, 6 Swape p L sah-Nyagan qui m’a et qui m’a fourni projet et aussi iance qu’elle m’a Mme Betscha Cosette pour ses précieux aides et conseils qui on permis à avance dans mes manipulations, Mlle Charlotte Bach pour tous ses conseils techniques qu’elle m’a donnée et qui m’ont permis de réaliser cette étude dans de bonnes conditions, Et l’ensemble de l’équipe biomatériaux et ingénierie tissulaire pour son soutien et sa bonne humeur.

Ainsi que toutes les personnes que j’ai eu l’occasion de rencontrer lors de ce stage et avec qui j’ai passé de très bons instants. Horse-radish-peroxydase ou péroxydase du raifort HSA: Human serum albumin ou serum albumine humain gG: Immunoglobuline G kDa: Kilodalton PBS: Phosphate buffer salin ou tampon phosphate salin H: Potenciel d’hydrogène PITC: Phenylisothyocyanate PTC: Phénylthiocarbomyl PTH AA: Phenylthloazolinone acide amné TMB: tetramethyl benzidine TFA: Acide trifluoroacétique Sommaire . Introduction 1. Les glandes surrénales 2.

Les cellules chromaffines 3. Le chromogranines I L’inserm 1. Inserm Unité 977 « biomatériaux et ingénierie tissulaire » 2. EA 44-38 « Stéroldes, Neuro-modulateurs et Neuro-pathologies I Matériels et méthodes . Matériels 2. Méthodes a. Sérum b. Pattes c. Dosage de protéines totales par la méthode de Bradford en plaque enzyme linked immunosorbent assay (E. L. I. S. A) d. Dosage de la CgA par la méthode ELISA e. Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (CLHP) f. Le principe du séquençage selon le principe d’Edman IV.

Résultats 1. Bradford 2. CGA-E. L. I. S. A 3. HPLC 2E de la biologie cellulaire et par la même occasion d’acquérir une premlere experlence. L’étude de mon stage porte sur l’analyse du plasma de rats ayant reçu des injections de peptides actifs et l’étude de l’effet des peptides sur la composition protéique au site d’injection sous l’influence d’un stress physique stimulé. Le stress est un syndrome d’adaptation de l’organisme aux perturbations. Réponse non spécifique que donne le corps ? toute demande qui lui est faite, c’est-à-dire à un stimulus.

Les systèmes nerveux, endocrinien et immunitaire permettent le retour de l’homéostasie chez l’homme après l’état de stress. Il est établi que le système immunitaire n’est pas indépendant mais régule l’activité des deux autres systèmes, tout en étant sous leur contrôle. Les cellules nerveuses peuvent communiquer entre elles grâce à des neurotransmetteurs et des neuropeptides. La communication des cellules endocrines st assurée par des hormones et celle du système immunitaire par des cytokines.

Cependant, il est maintenant établi qu’il existe une communication bidirectionnelle entre les systèmes neuroendocrine et immunitaire via les cytokines et leurs récepteurs une relation entre ces trois systèmes est possible grâce à des médiateurs et des récepteurs communs. Le stress induit par une infection ou une inflammation, produit une stimulation du système immunitaire et des messagers qui activent l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien, produisant la libération des catécholamines.

Un autre axe de régulation st sollicité lors d’épisodes de stress, c’est le système nerveux sympathique. L’action concertée des réponses nenteuses et endocrines vont permettre l’adaptation e sympathique. L’action concertée des réponses nerveuses et endocrines vont permettre l’adaptation et la défense de l’organisme. Les glandes surrénales sont situées au-dessus de chaque reins et présentent une dissymétrie l’une par rapport à Pautre. La glande surrénale, en sécrétant des hormones ou des enzymes va permettre le maintien de l’homéostasie.

Par exemple, elle va réguler des mécanismes comme le contrôle des ions sodium et otassium, l’augmentation de la pression artérielle, la régulation de la fréquence cardiaque ou encore l’apport de glucose vers les muscles. Les glandes surrénales sont dotées de deux structures de morphologie différentes : Le cortex surrénalien de couleur rouge-brun sécrète des glucocorticoïdes, des minéralcorticoides, des androgènes et des œstrogènes. Cette partie représente BO à 90% du poids de la glande.

La médullo-surrénale, de couleur plus claire, se situe au centre de la glande et est composée de cellules chromaffines. Les cellules chromaffines synthétisent et stockent les atécholamines, c’est-à-dire la noradrénaline et l’adrénaline qui seront par la suite libérées dans le système sanguin, dans les états de stress. L’adrénaline est une hormone sécrétée par la médullo-surrénale mais c’est également un médiateur chimique qui une fois libéré, agit sur les terminaisons nerveuses du système sympathique.

Elle joue un rôle dans l’augmentation du débit cardiaque et la pression artérielle et présente un effet dilatateur sur les vaisseaux du foie et du périphérique et une action constrictive sur les vaisseaux périphériques et une action ilatatrice de la crête neurale e 4 2E dilatatrice de la crête neurale, elles ont une origine commune avec les neurones du système nerveux central et périphérique. Ces cellules peuvent synthétiser et stocker des substances apparentées aux neurotransmetteurs. De plus elles sécrètent leur contenu granulaire en réponse à une stimulation.

Il existe deux types de cellules chromaffines : celles contenant l’adrénaline et celles synthétisant la noradrénaline. Ces cellules sont en contact par des terminaisons nerveuses et sont reliées les unes aux autres par des desmosomes. Les deux types de cellules ont séparés par une membrane basale, formant un espace extracellulaire par lequel elles sont libérer leurs composants intragranulaires qui se déverseront dans le sang Les cellules chromaffines contiennent un grand nombre de vésicules situées dans le cytoplasme.

Ces vésicules ou granules de sécrétion permettent de stocker des catécholamines et contiennent un grand nombre de molécules comme des protéines, des peptides, des enzymes, des nucléotides. Les chromogranines et sécrétogranines font parties de ces protéines contenues dans les vésicules. 3. Les Chromogranines (CCS) Les CGs sont des glycophosphoprotéines acides et solubles possédant un certain nombre de sites di- et tribasiques dans leur séquences d’acides aminés (AAs), correspondant à des sites potentiels de clivage protéolytique.

Cette famille est composée de chromogranine A (CgA), chromogranine B (CgB), chromogranine C ou sécrétogranine Il, les sécrétogranines Ill et IV et les protéines 732 et NESP55 (protéines neuroendocrine). Ces protéines sont produites généralement par d s E protéines 782 et NESP55 (protéines neuroendocrine). Ces protéines sont produites généralement par des granules de écrétion des cellules nerveuses, endocrines et immunitaires. La CgA est constituée d’une chaîne polypeptidique de 439 résidus d’un poids moléculaire de 49-52 kDa.

La CgA est sécrétée par deux glandes endocrines, situées au-dessus des reins. Les glandes surrénales sont divisées en deux structures bien distinctes : la médulla et le cortes. La médulla est située à l’intérieur de la surrénale, alors que le cortex en recouvre la surface. La médulla est constituée de cellules dites chromaffines qui contiennent entre autres des catécholamines (hormones du stress), et la CgA. Cette dernière constitue un groupe de protéines très hydrophiles, thermostables, et acides.

Le clivage de la CGA par des enzymes protéolytiques entraîne la formation de nombreux peptides dérivés bioactifs. La CgA agit comme une pro-hormone et l’apparition de ses peptides dérivés dépend des Sites de clivage. Les sites de phosphorylation et de glycosylation constituent autant de sites de modifications post- traductionnelles. De nombreuses études cliniques ont montré l’intérêt du dosage de la CgA circulante dans l’approche diagnostique et pronostique des tumeurs neuroendocrines. Ce marqueur général présente des concentrations sériques proportionnelles au volume tumoral.

Cinterprétation des taux de CgA prend en compte du siège de la tumeur primitive, fexistence de sécrétions hormonales associées et celle d’une insuffisance rénale. Selon le site clivé, les nombreux dérivés de peptides bioactifs ont des propriétés bien définies. Comme la Vasostatine-l (CgA 1-76) qui a la pr 6 E bioactifs ont des propriétés bien définies. Comme la Vasostatine- (CgA 1-76) qui a la propriété d’inhiber la croissance bactérienne à Gram positif, ou même la chromofungine (CgA 47-66) active ontre plusieurs souches de champignons filamenteux et de levures.

Il. L’Inserm L’Inserm est un organisme public français consacré à Fétude de la santé humaine avec pour objectif d’investir le champ de la recherche biomédicale fondamentale et appliquée. L’Inserm crée en 1964, comme successeur de l’institut national d’hygiène (INH). Présent sur tout le territoire français, divisé en 9 délégations régionales, constitué de 318 unités et 58 instituts fédératifs de recherche. Le personnel est composé en majorité de deux corps distincts : les chercheurs d’une part, et les ingénieurs et echniciens d’autre part.

Les chercheurs y effectuent des travaux de recherches biologiques, médicales et sur la santé des populations autours de la santé humaine Clnserm est présent dans tous les domaines de la recherche biologiques et représente 335 laboratoires et recherche et il existe huit instituts ayant des thèmes différents Neurosciences, neurologie, psychiatrie Génétique et développement Cancer Maladies infectieuses Circulation, métabolismes, nutrition Immunologie, hématologie, pneumologie Santé publique Technologie pour la santé Clnserm fait le lien entre la recherche fondamentale, la clinique, la hérapeutique et la recherche en santé publique. C’est pourquoi l’institut est en étroite relation dans son travail organismes de recherche et des hôpitaux.

Leurs rincipaux partenaires sont des organismes de protection recherche, les universités, partenaires sont des organismes de protection sociale ou de recherche, les universités, les hôpitaux, les centres de lutte contre le cancer, mais également des associations de malades. ‘industrie est également un collaborateur e l’Inserm, puisqu’il existe environ 1000 contrats entre ces deux secteurs. Accueille par le Dr. Metz Boutique au sein de son unité qui est ntégré dans l’institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM) unité 977 intitulé biomatériaux et ingénierie tissulaire Cunité 977 situé dans les locaux de la faculté de chirurgie dentaire de Puniversité de Strasbourg.

Les travaux et expériences effectuées dans cette équipe porte sur la conception de nouveaux biomatériaux, la réparation, Pingénierie tissulaire dans le domaine de l’odontologie, de pathologie osseuses en autres. Cette unité a été conçu dans le but d’améliorer la fonctionnalité de biomatériaux implantables en les rendant « bioactifs » et ? l’élaboration de nouvelles architectures polymériques pour optimiser l’intégration des implants biomédicaux. 2. EA 44-38 « Stéro-ldes, Neuro-modulateurs et Neuropathologies Localisée dans le bâtiment 3 de la Faculté de Médecine de Strasbourg, le principal objectif de l’équipe est de fournir des données utiles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les neuropathologies.

Grâce à une approche multidisciplinaire associant des méthodes de biologie cellulaire et moléculaire, de neuro-anatomie, de biochimie, de pharmacologie, et de neurosciences comportementales, l’équipe ?tudie en d’autres le rôle des neuro-stéroides, du gamm neurosciences comportementales, l’équipe étudie en d’autres le rôle des neuro-stéroides, du gamma hydroxybutyrate et de leurs analogues dans la protection contre les processus dégénératifs et neuroinflammatoires responsables des neuropathies, des douleurs pathologiques. L’intégration de plusieurs types d’analyses est une stratégie de recherche translationnelle développée par l’équipe pour caractériser des molécules ou agents neuro-protecteurs efficaces. Le laboratoire utilise diverses techniques telles que l’Elisa, le dosage, le couplage HPLC- Détection en flux continu. L’unité 977 et Punité EA44-38 sont en collaborations pour ce projet. Les échantillons proviennent de l’unité EA 44-38 et le projet a été effectué dans les locaux de l’unité 977 qui possède les équipements adéquate pour mener à termes ce projet. Ill. Matériels et méthodes I.

Matériels Les échantillons ont été préparés par Péquipe de stéroïdes, neuro-modulateurs et pathologies dirigé par le Pr. Mensah- Nyagan. es échantillons utilisés pour ce projet sont des sérums et des pattes de rat. Ces échantillons proviennent de 23 rats mâles Spragues-Dawles de 200g. Les rats ont été numérotés de un ? vingt-trois et annotés par une lettre : B, N, V ou R qui signifie les couleurs blanc, noir, verte ou rouge servant à la distinction des rats entre eux. Chaque rat reçoit par injection intra-planétaires un des peptides CGA à une concentration bien définie, 0,5mg. kg-1 ou 2mg. kg-1 à raison de 20 pl_/250g de poids corporel.

La patte ayant reçue une injection de façon ipsilatérale reçoit la solution avec le peptide et la patte ayant reçue une injection de façon contralatérale reçoit la solution san eptide et la patte ayant reçue une injection de façon contralatérale reçoit la solution sans le peptide (NaCl La patte contratérale est un contrôle interne et permet d’effectuer une comparaison avec la patte injectée. Certains rats n’ont reçu que le véhicule NaCl sur les deux pattes. Ces rats dits naifs, permettent de réaliser un contrôle externe et le standard. La répartition des injections des différents peptides : Peptide CGA 47-66 CGA 6 NaCl Concentration 2mg. kg-1 0,5mg. g-1 Nombres de rats 6 7 5 Deux tests ont été réalisés pour déterminer l’effet anti-nociceptif es peptides sur le système nerveux des rats. Sensibilité nociceptive mécanique : Le test des filaments de Von Frey Le test des filaments de Von Frey permet de mesurer le seuil de retrait de la patte et ainsi de déterminer le seuil de sensibilité nociceptive mécanique. Ce test est réalisé avec des filaments de Von Frey calibrées ? 4, 10, 15, 26, 50, 100, 180 et 300g, appliqués à la surface de la patte du rat où a eu lieu l’injection jusqu’à ce que le filament se déforme. On applique les filaments avec un intervalle de quatre à cinq secondes pendant ne à deux secondes et 0 6