Hybridation in situ

Hybridation moléculaire « in situ » Plan : – Qu’est-ce que l’hybridation in situ ? A – Principe général B – Nature des Sondes C – Marquage des sondes D – Mode opératoire Il – Hybridation in situ en Embryologie A – Son Utilité en embryologie B – Exemple chez la Drosphila melanogaster La première hybridat- en 1969 par Joe Gal e Mary-l_ou pardue. Ce moléculaire.

L’utilisat celle-ci été considéra org Snipe to View pour la première fois e la cytogénétique s les années 1980. I – Qu’est-ce que l’hybridation in situ ? L’hybridation in situ est une technique consistant à localiser une équence nucléotidique connue au sein des cellules d’une coupe histologique ou d’un organisme entier. Cette séquence peut être de l’ADN ou de [‘ARN.

Le principe de cette technique repose sur la capacité que possèdent deux chaines d’acides nucléiques complémentaires à s’hybrider pour former une double hélice et grâce à la complémentarité des bases azotées (Adénine avec Thymine (ou Uracile) et Cytosine avec Guanine). Ainsi, pour pouvoir localiser une molécule d’ADN ou ARN, on doit essentielle en ce qui concerne l’ADN et se calcule en fonction du nombre de G-C et de A-T mais également en fonction de la longueur de la chaine ucléotidique.

La nature de la sonde peut être différente en fonction du site d’hybridation B – Nature des sondes Nature de la sonde ADNc double brin Origine de fabrication Obtenu par clonage dans un plasmide et amplifié par PCR – Forte stabilité Avantage – Obtenu en grande quantité ADNc monocaténaires asymétrique – Forte Stabilité – Ne nécessite pas de dénaturation – pas d’hybridation inter-sonde – Marquage lors de la synthèse par PCR Inconvénients température d’hybridation délicate – La séquence choisie peut être difficile d’accès ADN ou ARNm 2 Spécificité de la sonde :

La sonde doit s’hybrider avec une séquence précise qu’il faut préalablement bien choisir (séquence codante ou non, introns/exons,… ) La taille de la sonde dolt être également chosie, assez longue pour assurer une bonne stabilité et assez courte pour qu’il y ait une bonne pénétration dans les tissus. L’hybridation avec l’ARNm est difficile car il faut connaître la structure de l’ARNm mature. En effet, le transcrit primaire contient les introns. C – Marquage de la sonde Afin de localiser où se produit ‘hybridation, il faut marquer la sonde. Ce marquage diffère en fonction de la nature de la sonde et de son lieu d’hybridation.

Marquage Isotopes radioactifs (tritium H3, P32 ou S35) Produits fluorescents (on parle alors FISH) (Antigènes) Haptènes ou Digoxygénine Biotine (Vitamine H) Des enzymes (phosphatase alcaline) Révélation Autoradiographie Microscopie à fluorescence Anticorps Protéines Avidine ou Streptavidine Substrat, Anticorps ou Chromo ènes utiliser des échantillons de tissus de différentes natures : Tissus frais Tissus congelés à -800C Tissus fixées dans le formaldéhyde Tissus fixées et paraffinés (mauvaise sensibilité) La fixation a pour but d’arrêter le métabolisme cellulaire, inactiver les RNAses et conserver la orphologie ainsi que l’intégrité des acides nucléiques au sein des tissus. Le paraffinage sert quant à lui à prolonger la conservation des tissus. Les tissus doivent subir un traitement ayant pour but de permettre à la sonde marquée d’atteindre l’acide nucléique cible et de diminuer les liaisons non spécifiques.

Ce traitement se compose : une post-fixation : permettant d’inactiver les RNAses et de stabiliser les structures de l’échantillon. Cette étape est utile pour les échantillons déjà fixés et nécessaires aux tissus congelés et frais. Une perméabilisation et déprotéinisation nécessaires car les iaisons covalentes formées par le formaldéhyde empêchent l’accès aux sondes dans les cellules. o Perméabilisation : lyse partielle des membranes plasmiques par des détergents (saponine, triton, ou des li ases ou l’éthanol o Déprotéinisation : élimin téines liées aux acides d’hybridation sans les sondes. Cette étape peut néanmoins diminuer la sensibilité de l’échantillon aux sondes. – L’hybridation Cette étape consiste à incuber les coupes histologiques dans le milieu d’hybridation, contenant les sondes marquées et le tampon d’hybridation, à une température permettant une hybridation in situ spécifique. plusieurs paramètres d’hybridation sont à prendre en compte comme la Tm, mais également le pH du milieu, le choix du tampon d’hybridation en fonction de la longueur, la nature et le marquage des sondes, La durée de la réaction est aussi important car dans le cas d’une hybridation avec l’ARNm, lorsque le seuil de saturation de rARNm cible est atteint, la quantité de sonde spécifiquement hybridée n’augmente plus, ce qul n’est pas le cas du bruit de fond (fixations non spécifiques faussant les résultats). – Le lavage et révélation des hybrides Le lavage a pour but d’éliminer Hexcès de sonde non hybridée et e dissocier les hybrides illégitimes (diminuer le bruit de fond). Cette étape va s’effectuer avec une adaptation de la stringence (z conditions d’appariements d’un acide nucléiques donné). La révélation va se faire en fonction du type de marquage de la sonde. L’hybridation in situ a permis de nombreuses découvertes tant en Génétique que dans d’autres disciplines biologiques. En technique du FISH contrôlant la migration des cellules durant l’embryogénèse ainsi que leur prolifération et leur différentiation en divers tlssus. En embryologie, cette approche expérimentale permet de déterminer où un gène est exprimé ans un tissu.

En effet, les cellules fabriquant l’ARNm d’un gène donné seront identifiées grâce à l’hybridation des sondes. Néanmoins, la transcription d’un ARN ne signifie pas automatiquement que la protéine codée par ce gène est présente et/ou en quelle quantité. Pour savoir si la protéine est présente, il faudra utiliser une autre technique appelée l’immunohistochimie. C’est une étape importante dans la compréhension de résultats, notamment si on étudie l’expression d’un facteur secrété. L’hybridation in situ indiquera les cellules qui font la transcription de l’ARNm, mais n’indiquera pas si PARNm est traduit n protéine, si cette protéine est secrétée, et à quelle distance des cellules productrices.

La facilité avec laquelle les hybridations in situ sont faites, en comparaison de la difficulté ? fabriquer des anticorps, entraîne utilisation privilégiée de cette technique. L’hybridation in situ permet une première approche concernant l’expression génique en ARNm. On peut l’utiliser pour localiser des tissus, comme le tissu nerveux en hybridant les ARNm de l’endophiline A (protéine du système nerveux) d’un embryon de Drosophile. Cette technique permet égalem re les mécanismes de la recherche en énétique comme d’en d’autres disciplines. De plus, son génome a été entièrement séquencé ce qui permet aux chercheurs d’économiser du temps.

De ce faite, la Drosophile est devenue un outil d’étude de nombreux processus développementaux et physiologiques, qu’elle permet d’analyser aux niveaux moléculaires et cellulaires. Les chercheurs en embryologie se sont intéressés ? l’embryogénèse précoce de cette petite mouche et notamment sur la mise en place les axes de symétries. Comme nous l’avons précédemment vue dans l’exposé n06, des gènes à effets maternels sont nécessaires au éveloppement embryonnaire de la Drosophile. L’axe antéro postérieur se mettant en place précocement chez l’embryon, les scientifiques se sont interrogés pour savoir si ces gènes à effets maternels avaient un rôle dans cette mise place de l’axe. Dans cette partie nous allons essayer de vous montrer le raisonnement et les étapes qu’on suivit les chercheurs.

En premier lieu ils ont réalisés une hybridation in situ de l’ARNm du gène Bicoid avec une sonde ARN complémentaire, leur permettant ainsi de localiser au niveau de l’embryon où était transcris ce gène. Une autre hybridation in situ a été ?galement réalisée avec l’ARNm du gène Nanos. La sonde a été marquée par des isotopes radioactifs et la révélation sur la coupe histologique s’est faite par autoradlog aphie. Suite à la révélation, on peut voir que les ARNm de Bicoïd se situent à l’extrémité du blastoderme et que les ARNm de Nanos se situent à l’extrémité opposée. Cette répartition iné ale des ARNm a mis sur la voie les scientifi concerne la mise en place de l’axe antéro-postérieur. Suite à une immunohistochimie, les scientifiques ont constaté les gènes Bicoid et Nanos ne s’expriment pas dans tout l’embryon, Bicoid s’exprime dans la uture partie antérieur et Nanos dans la future partie postérieure. Leurs protéines se répartissant en un gradient de concentration sur l’animal. Afin d’être sure que Bicoïd défini la mise en place de l’axe antéro postérieur, les scientifiques ont réalisées les expériences suivantes. L’absence de Bicoid chez l’embryon forme un asticot sans tête. De plus, si on prélève des protéines Bicoid d’un un embryon sein et qu’on les injecte dans l’embryon muté à un endroit précis, on obtiendra un asticot avec une tête formée ? l’endroit de l’injection.

Ceci prouve bien que Bicoid permet la formation de la tête de fasticot. En conclusion, les scientifiques ont pu affirmer que les gênes Bicoïd et Nanos étaient bien responsables de la mise en place de l’axe antéro-postérieur et que sans leurs présences différents éléments dégénéraient (tant au niveau morphologique mais également sur l’expression d’autres gênes car ces deux gènes ont une action répresslve et activatrice). Grâce à la technique de Vhybridation in situ, ils ont pu localiser les cellules qui réalisaient la transcription de ces deux gênes et par d’autres techniques (donc l’immunohistochimie) ont pu identifier la propagation la es protéines produites ? PAGF8CFq